Celbiologie I - Practica

Enable MathJax-mhchem

$\require{mhchem}$

Celbiologie 1 - Practica¶

Practicum 1: fotometrische dosage van eiwitten¶

Practicum 2: DNA: structuur, amplificatie, restrictiedigestie, gelelektroforese¶

Practicum 3: koolhydraten en lipiden¶

Practicum 4: enzym kinetica¶

Theorie¶

• evenwichtsconstante voor $\ce{A -> B}$: $K_{eq} = \dfrac{[B]}{[A]}$
• biologische evenwichtsconstante $K'_{eq}$
  • $\ce{[H2O]} = 1$
  • $\ce{[H+] = [H3O+]} = 10^{-7} mol/l = 1$
    • $pH = 7$

Michaelis-Menten kinetica¶

• omzettingssnelheid $v$ (in mol/min) van substraat $S$ in product $P$ m.b.v. enzym $E$
  • $v = \dfrac{d[P]}{dt} = -\dfrac{d[S]}{dt}$
  • $\ce{E + S <=> E-S <=> E-P <=> E + P}$
  • vereenvoudigd: $\ce{E + S <=>[k_1][k_2] E-S <=>[k_3][k_4] E + P}$
• voorwaarden
  • 1 substraat $S$
  • $[S] \gg [E]$
  • nog niet veel product gevormd, dus $[S]$ stabiel
• steady-state assumptie
  • $\ce{[E-S]}$ constant
  • dus als aanmaak = afbraak
    • $k_1 [E] [S] = k_2 \ce{[E-S]} + k_3 \ce{[E-S]}$
  • kan enkel als $[S]$ hoog en $[P]$ laag
• parameters
  • $V_{max} = k_3 ([E] + [\ce{E-S}]) = k_3 [E_t]$: maximale omzettingssnelheid (eenheid mol/min)
  • $K_m = \dfrac{k_2 + k_3}{k_1} = \dfrac{[E] [S]}{[\ce{E-S}]}$: Michaelis-Menten constante (eenheid mol/l)
    • lager ~ reactiever substraat
• $v([S]) = \dfrac{[S]}{K_m + [S]}V_{max}$
  • afleiding: zie practicumboek
  • hyperbool in variabele $[S]$
  • $[S] \ll K_m \implies v([S]) \approx \dfrac{V_{max}}{K_m} [S]$
    • lineair verband
  • $[S] \gg K_m \implies v([S]) \approx V_{max}$
  • $v(K_m) = \frac{1}{2} V_{max}$
• omzettingsgetal $k_{cat} = k_3? = \dfrac{V_{max}}{[E_t]}$
  • hoeveel $S$ per seconde kan omgezet worden naar $P$ door 1 $E$
  • cat: catalysis
  • eenheid: $\dfrac{1}{s}$

Linearisatie¶

• risico: uitvergroting meetfouten door niet-lineaire transformaties
• Lineweaver-Burk
  • $\dfrac{1}{v}\left(\dfrac{1}{[S]}\right) = \dfrac{1}{V_{max}} + \dfrac{K_m}{V_{max}} \dfrac{1}{[S]}$
  • $\dfrac{1}{v}\left(\dfrac{-1}{K_m}\right) = 0$
  • $\dfrac{1}{v}(0) = \dfrac{1}{V_{max}}$
• Eadie-Hofstee
  • $v\left(\dfrac{v}{[S]}\right) = V_{max} - K_m \dfrac{v}{[S]} \iff \dfrac{v}{[S]}(v) = \dfrac{V_{max}}{K_m} - \dfrac{v}{K_m}$
  • $v(0) = V_{max}$
  • $v\left(\dfrac{V_{max}}{K_m}\right) = 0$
  • rico: $-K_m$
• Hanes-Woolf
  • $\dfrac{[S]}{v}([S]) = \dfrac{K_m}{V_{max}} + \dfrac{[S]}{V_{max}}$
  • $\dfrac{[S]}{v}(-K_m) = 0$
  • rico: $\dfrac{1}{V_{max}}$

Inhibitoren¶

• $I$: inhibitor
• $K_i$: dissociatie constante van $I$, eenheid mol/l?
  • hoe groter, hoe meer $I$ nodig om reactie te vertragen
• drie soorten
  • competitieve inhibitie
    • $S$ en $I$ binden op zelfde plaats aan $E$
    • $V_{max}^{inh} = V_{max}$
      • want bij heel hoge $[S]$ is $[I]$ verwaarloosbaar
    • $K_m^{inh} = K_m \left(1 + \dfrac{[I]}{K_i}\right) \geq K_m$
      • $K_i \uparrow \implies K_m^{inh} \downarrow \implies$ snellere omzetting
    • Lineweaver-Burk: lijnen snijden in $\left(0, \dfrac{1}{V_{max}}\right)$, dus waar $[S] = +\infty$ en $v=V_{max}$
  • niet-competitieve inhibitie
    • $S$ en $I$ binden op verschillende plaats op $E$
    • $V_{max}^{inh} = \dfrac{1}{1 + \frac{[I]}{K_i}} V_{max} \leq V_{max}$
      • deel van $E$ zijn inactief
      • cf. $V_{max} = k_{cat} [E_t]$
    • $K_m^{inh} = K_m$
      • de resterende $E$ werken zoals voorheen
    • Lineweaver-Burk: lijnen snijden in $\left(\dfrac{-1}{K_m}, 0\right)$
  • oncompetitieve inhibitie
    • $I$ bindt enkel aan $\ce{E-S}$, zodat $\ce{E-S-I}$ inactief is
    • $V_{max}^{inh} = \dfrac{1}{1 + \frac{[I]}{K_i}} V_{max} \leq V_{max}$
    • $K_m^{inh} = \dfrac{1}{1 + \frac{[I]}{K_i}} K_m \leq K_m$
    • Lineweaver-Burk: lijnen parallel

Experimenteel gedeelte¶

• $S$: p-nitrofenylfosfaat (pNPP)
• $P$: nitrofenol
• $E$: alkalisch fosfatase (AF)
  • EC 3.1.3.1, hydrolase
• $I$: $\beta$-glycero-fosfaat

Opstellen ijklijn¶

$f(x) = 0.0213x - 0.0240 \iff f^{-1}(y) = \dfrac{y + 0.0240}{0.0213}$

Parameters bepalen¶

• $[S]_1 = \dfrac{100 mM \cdot 0.25 ml}{2 ml} = 12.5 mM$
• $[S]_2 = \dfrac{50 mM \cdot 0.25 ml}{2 ml} = 6.25 mM$
• ...

• normaal: $\dfrac{1}{v} = \dfrac{1}{V_{max}} + \dfrac{K_m}{V_{max}} \dfrac{1}{[S]} = 0.2036 + 0.0684 \dfrac{1}{[S]}$
  • $\dfrac{1}{V_{max}} = 0.2036 \iff V_{max} = 4.9116$ μmol/min
  • $\dfrac{K_m}{V_{max}} = 0.0684 \iff K_m = 0.0684 V_{max} = 0.3360$ mM
  • alternatief: $0.2036 + 0.0684 \dfrac{-1}{K_m} = 0 \iff \dfrac{-1}{K_m} = \dfrac{-0.2036}{0.0684} = -2.9766 \iff K_m = 0.3360$
• met inhibitor: $\dfrac{1}{v} = \dfrac{1}{V_{max}^{inh}} + \dfrac{K_m^{inh}}{V_{max}^{inh}} \dfrac{1}{[S]} = 0.3265 + 0.4884 \dfrac{1}{[S]}$
  • $\dfrac{1}{V_{max}^{inh}} = 0.3265 \iff V_{max}^{inh} = 3.0628$ μmol/min
  • $\dfrac{K_m^{inh}}{V_{max}^{inh}} = 0.4884 \iff K_m^{inh} = 0.4884 V_{max}^{inh} = 1.4959$ mM
• soort inhibitor
  • $K_m$ liggen ver uit elkaar maar $V_{max}$ liggen dicht(er) bij elkaar
  • LB grafiek: snijpunt bij $x \approx 0$
  • wijst op competitieve inhibitor
  • dus $K_m^{inh} = K_m \left(1 + \dfrac{[I]}{K_i}\right)$
  • $\iff K_i = \dfrac{K_m [I]}{K_m^{inh} - K_m}$
  • $[I] = \dfrac{100 mM \cdot 0.25 ml}{2 ml} = 12.5 mM$
  • $K_i = \dfrac{0.3360 mM \cdot 12.5 mM}{1.4959 mM - 0.3360 mM} = 3.621 mM$

Practicum 5: structuur van macromoleculen¶